Ich möchte einen Migrationsassay mit humanen Gliomzellen durchführen. Nach Ablauf der Inkubationszeit (16 h) sollen die migratorischen Zellen auf der Membranunterseite immuncytochemisch charakterisiert werden (EphB4-Färbung).
Was ist zu beachten? Wird die Färbung lichtmikroskopisch darstellbar sein?
ThinCert™ Zellkultureinsätze eignen sich sehr gut für immuncytochemische Färbetechniken. Prinzipiell sind sowohl durchlichtmikroskopische, als auch fluoreszenzbasierte Nachweismethoden einsetzbar.
Da die Poren der Insertmembran im Durchlicht mit dem durch die Membran tretenden Lichtstrahl interferieren
(z. B. Streuung des Lichtes an den Poren) ist Durchlichtmikroskopie limitiert. Mit fluoreszenzbasierten Methoden erzielt man in der Regel die besseren Ergebnisse.
Wenn die Möglichkeit zur Fluoreszenzmikroskopie besteht, sollte dieser Methode der Vorrang gegeben werden.
Optimal ist konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Wenn keine Möglichkeit der Fluoreszenzmikroskopie besteht, sind zumindest transparente Inserts für die Durchlichtmikroskopie zu verwenden.Prinzipiell könnte ein derartiges Experiment folgende Schritte beinhalten:
1. Zellen auf Insert ausbringen (Hinweise hierzu im Applikationsprotokoll zum Thema Zellmigration, PDF)
2. Zellmigration über 16-24 h
3. Entfernung nichtmigratorischer Zellen durch Abwischen der oberen Membranseite mit einem Wattestäbchen
4. Fluoreszenz-Immunfärbung im Insert (Hinweise hierzu im Applikationsprotokoll mit dem Titel "The reconstruction and immunocytochemical characterisation of polarised epithelia in ThinCert™ cell culture inserts", PDF)
5. Heraustrennen der Insertmembran und Aufziehen auf einen Objektträger, Eindeckeln
6. Fluoreszenzmikroskopie (ggf. konfokal)